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徠卡超薄切片技術介紹

發布時間:2021-03-26      點擊次數:134

對樣本開展研究時,為了以納米級分辨率顯示其精細結構,通常會使用到電子顯微鏡。

電子顯微鏡有兩種類型:掃描電子顯微鏡(SEM)用于對樣本表面成像,以及需要使用極薄電子透明樣本的透射電子顯微鏡(TEM)。因此,使用電子顯微鏡對樣本內部的精細結構進行成像時,此類技術解決方案需要制作出非常薄的樣本切片。被稱為超薄切片技術的樣本制備方法可以產生具有最小假象的超薄切片(厚度20-150nm)。

在切片過程中,樣本的塊面(切割切片處)始終保持在一個平直的表面上,可供SEM進行研究。當截面在陣列中成像時,就可以重建樣本的三維圖像。這種方法稱為陣列斷層掃描(AT)。超薄切片技術及其在AT中的應用概述如下。

 

超薄切片技術

 

超薄切片技術主要用作透射電子顯微鏡(TEM)的樣本制備方法。它允許樣本的內部結構以納米級分辨率進行可視化和分析。它以快速、干凈的方式制作超薄的樣本切片。超薄切片技術的一個主要優點是切片內電子透明區域的大小和均勻性以及切片產生的速度。

超薄切片技術可用于多種類型的樣本,包括生物學試樣和工業材料如聚合物(橡膠和塑料)以及韌性、硬質或脆性材料(金屬或陶瓷)等。制備這些樣本薄片還有其他技術,如聚焦離子束(FIB)銑削、離子刻蝕、三腳架拋光和電化學處理,但超薄切片技術在速度和清潔度方面具有優勢。

陣列斷層掃描 (AT) 是一種用于細胞和蛋白質結構分析的高分辨率三維圖像重建方法。該技術利用掃描電子顯微鏡(SEM)或光學顯微鏡(LM)中超薄、樹脂包埋連續切片的有序陣列成像。AT技術能夠對細胞及蛋白質結構開展定量立體結構分析和可視化觀察。其橫向和空間分辨率比傳統的共焦顯微鏡更理想。此外,通過生物試樣的部分自動化檢測來實現更高的處理量。

 

超薄切片原理


利用陣列斷層掃描進行TEM觀察以及實現優化3D重建時,超薄有序的切片是一大前提。超薄切片機(如徠卡顯微系統的EM UC7)則可以制作出此類超薄的樣本切片(厚度20 ~ 150 nm)。

要在透射電子顯微鏡中形成樣本的圖像,電子必須在不出現任何重大速度損失的情況下穿透樣本。樣本對電子輻射的滲透率部分取決于其質量和厚度(厚度×密度),部分取決于電子顯微鏡的加速電壓。被試樣吸收的電子會導致熱量積聚,從而在物體中形成假象。

 

圖1:顯示超薄切片機樣品臂、刀座和水槽式玻璃刀的側視圖。

 

使用超薄切片機進行切片時,需將樣本插入安裝在特殊軸承上的樣品臂當中,由該軸承執行垂直切割運動。切割截面并縮回試樣支臂后,極其準確的機電進給將試樣稍微向前移動,移動距離與所需截面厚度相對應。通過將試樣垂直移動到固定玻璃刀或金剛石刀的鋒利刀片上進行切片。由于切片過薄,直接從刀片上取下切片很困難。

因此,它們是在切片程序后從水槽中水面上收集的(或在冷凍切片的情況下借助顯微操作器)。在用電子顯微鏡(EM)檢查之前,可能需要做任何進一步的準備。

 

陣列斷層掃描的試樣制備

 

為AT制備生物學軟試樣時需要完成若干步驟的操作。這些步驟包括:

  • 組織固定
  • 試樣提取和樹脂包埋
  • 連續切片和切片帶收集,形成切片陣列
  • 視需要對切片進行染色以供成像。

然后通過SEM或LM(通常為熒光)對切片陣列成像。后續將陣列中的切片圖像合并在一起進行3D圖像重建和分析。

很多超薄切片機的AT樣本制備涉及多個耗時繁瑣的手動操作步驟。高級超薄切片機(如徠卡顯微系統ARTOS 3D)則可通過試樣切片的自動化處理來加速整個制備過程,最大限度縮短SEM或LM成像中的切片處理時間。

 

應用圖像

 

圖2:陣列斷層掃描(ARTOS 3D)高級超薄切片解決方案的金剛石刀頭圖片,可用于執行自動連續切片??梢姾穸染鶆虻臒o褶皺條帶漂浮在水槽內的水面上。

 

 圖3:黃金的切片表面– AFM圖像

 

圖4:銅與黃金層的橫截面 – TEM圖像。感謝德國WWU Münster提供的圖片

 

圖5:通過陣列斷層掃描采集到的小鼠淋巴細胞的3D圖像重建。感謝奧地利克洛斯特新堡科技研究院(IST)提供的圖片。

 

圖6:酸硫桿狀菌 HV2/2。感謝馬堡大學Dr. Andreas Klingl提供的圖片。

 

圖7:大鼠腎臟。感謝德國漢堡大學L. Edelmann提供的圖片。

 

圖8:擬南芥。感謝根特大學Riet De Rycke提供的圖片。

 

圖9:擬南芥。感謝根特大學Riet De Rycke提供的圖片。

 

圖10:小鼠心臟。感謝根特大學Riet De Rycke提供的圖片。

 

圖11:小鼠心臟。感謝根特大學Riet De Rycke提供的圖片。

 

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